Dalle terapie geniche ai farmaci antitumorali personalizzati che richiedono indagini di laboratorio specifiche, la droplet digital PCR è una risorsa straordinaria per ottenere risultati analitici affidabili.
La tecnica di replicazione del DNA nota come reazione a catena della polimerasi (PCR) è stata sviluppata quasi 40 anni fa dal biochimico e premio Nobel Kary Mullis ed è oggi il metodo più utilizzato in biologia molecolare.
Non si può sottolineare abbastanza come la PCR abbia cambiato le dinamiche del lavoro di laboratorio, in particolare nelle aree della medicina legale, del cancro, delle malattie genetiche e delle malattie infettive. La PCR consente di amplificare le sequenze errate associate alle malattie e senza questa tecnica non saremmo in grado di sviluppare le terapie geniche che hanno pervaso il campo dei farmaci a grandi molecole.
Prima che arrivasse la PCR, l’unico modo per produrre copie multiple di un gene era clonare il DNA, un processo lungo che prevede l’inserimento di un gene di interesse in cellule batteriche viventi e la replica del gene insieme al DNA durante il processo di divisione e replicazione. La PCR ha cambiato questa dinamica e non solo. I ricercatori continuano a trovare applicazioni nuove e innovative per la PCR e nuove versioni tecnologiche. L’approccio più potente è la droplet digital PCR (ddPCR).
La ddPCR è una forma di PCR digitale che funziona come la PCR convenzionale, tranne per il fatto che suddivide i campioni di DNA in migliaia di camere di reazione separate. Il termine ‘droplet’ deriva dal metodo utilizzato: un’emulsione acqua-olio che divide i campioni in 20.000 goccioline. L’amplificazione della PCR avviene in ogni gocciolina e i compartimenti che finiscono per contenere la molecola bersaglio completano la PCR e si leggono come ‘positivi’ mentre quelli che non contengono DNA si registrano come negativi. È qui che entra in gioco il termine digitale, in quanto è una risposta sì o no, o 0-1.
A differenza dei saggi di cromatografia o di legame del ligando in cui l’intensità di un segnale viene misurata in parallelo con le curve di calibrazione, la ddPCR fornisce i mezzi per contare il numero assoluto di molecole di DNA o RNA in ciascun campione, rendendo teoricamente il test più preciso e sensibile.
Valutazione dei vettori virali in terapia genica
Le terapie geniche – che comportano il trasferimento di materiale genetico, di solito un veicolo o vettore, e l’introduzione del gene nelle cellule appropriate – rappresentano una delle aree di impiego più interessanti della ddPCR, sebbene molti laboratori utilizzino ancora il metodo PCR convenzionale. Una capacità chiave della ddPCR è la valutazione della biodistribuzione dei vettori virali utilizzati per guidare le terapie geniche nelle cellule. Quando si tratta un animale o un essere umano con una terapia genica basata sul vettore virale, è infatti importante quantificare la quantità di vettore che rimane nel tessuto perché se la concentrazione del virus è troppo alta potrebbe causare danni, e se è troppo bassa la terapia genica potrebbe non funzionare. La PCR standard affronta questa questione attraverso la correlazione tra il segnale e la concentrazione della sostanza, cercando di collegarli. La PCR digitale evita questo cimento perché non è necessaria una curva di calibrazione su cui basare i risultati. Con la ddPCR si contano letteralmente le molecole di DNA o RNA presenti nel campione, per un risultato quantitativo assoluto e molto sensibile.
Misurazione del DNA mutato
Naturalmente la ddPCR non è utile solo per valutare i numeri di copie del genoma delle terapie geniche. È anche particolarmente preziosa nel determinare le mutazioni in alcune cellule tumorali o nel sangue del paziente. In genere, i laboratori cercano il DNA delle cellule tumorali nel plasma. Il problema con questo approccio è che i livelli di DNA mutato sono così bassi che sono difficili da distinguere dal normale DNA nel plasma. In altre parole, se si utilizza la PCR convenzionale per rilevare il DNA mutato, il segnale andrà perso tra il rumore proveniente dal DNA delle cellule normali. Con la ddPCR, questa problematica può essere aggirata isolando il DNA mutato e non mutato in goccioline diverse, rendendo i risultati più facili da rilevare.
Caratterizzazione in terapie cellulari
La ddPCR assume rilevanza anche nell’alveo delle terapie cellulari. Alcune terapie cellulari comportano una sorta di mutazione diretta in cui un pool di cellule viene prelevato da un paziente e modificato per conferire loro proprietà terapeutiche. Queste terapie cellulari possono poi essere somministrate nuovamente allo stesso paziente. La cosa interessante della ddPCR è che la terapia cellulare può essere caratterizzata in modo migliore, perché le percentuali di cellule che sono state modificate possono essere facilmente determinate.
Regolamentazione sulla ddPCR
La scienza spesso si muove più velocemente dei regolamenti e le applicazioni PCR non fanno eccezione. Sebbene le autorità di regolamentazione riconoscano che la PCR è la tecnica più adeguata per valutare la biodistribuzione per le terapie geniche e cellulari, non distinguono quale tipo di PCR è il migliore e non esistono requisiti che specifichino quale metodo utilizzare. Ciò che è importante è l’armonizzazione dei sistemi per garantire risultati coerenti.
Charles River è stata la prima ad offrire la ddPCR in Canada e questa tecnica è disponibile anche in altri sei dei siti dell’azienda negli Stati Uniti e in Europa. Tutte le procedure di impiego sono armonizzate, dalla qualificazione dello strumento alla convalida dei sistemi, il che significa che un test può essere facilmente trasferito da un sito all’altro garantendo gli stessi risultati. Charles River è anche in grado di trasferire analisi dai clienti o progettare analisi da zero. Capacità fondamentali per sostenere lo sviluppo di prodotti farmaceutici e terapie avanzate attraverso risultati analitici affidabili.
